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单细胞转录组基础分析六:伪时间分析

   日期:2024-12-11     作者:caijiyuan    caijiyuan   评论:0    移动:http://xiaoguoguo.dbeile.cn/mobile/news/3198.html
核心提示:单细胞测序技术是近年最大的生命科学突破之一,相关文章频繁发表于各大顶级期刊,然而单细胞数据的分析依然是大家普遍面临的障碍

单细胞测序技术是近年最大的生命科学突破之一,相关文章频繁发表于各大顶级期刊,然而单细胞数据的分析依然是大家普遍面临的障碍。本专题将针对10X Genomics单细胞转录组数据演示各种主流分析,包括基于Seurat的基础分析、以及基于clusterProfiler、Monocle、SingleR等R包的延伸分析。不足之处请大家批评指正,欢迎添加Kinesin微信交流探讨!

单细胞转录组基础分析六:伪时间分析

Monocle进行伪时间分析的核心技术是一种机器学习算法——反向图形嵌入 (Reversed Graph Embedding)。它分析的前提需要一张展现细胞转录特征相似性关系的图,Monocle2使用DDTree降维图,Monocle3使用UMAP降维图。Monocle的机器学习算法可以依据上述降维图形,学习描述细胞如何从一种状态过渡到另一种状态的轨迹。Monocle假设轨迹是树状结构,一端是“根”,另一端是“叶”。一个细胞在生物过程的开始,从根开始沿着主干进行,直到它到达第一个分支。然后,该细胞必须选择一条路径,并沿着树移动越来越远,直到它到达一片叶子。一个细胞的假时间值是它返回根所需的距离。降维方面monocle与seurat的过程大同小异,首先进行数据标准化,其次选择部分基因代表细胞转录特征 ,最后选用适当的算法降维。对Monocle原理感兴趣的同学可以登录官网查看:

http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/

数据导入与处理

轨迹分析的前提是待分析的细胞有紧密的发育关系,PBMC细胞不是很好的的示例数据,我们选择T细胞群体演示一下。Monocle建议导入原始表达矩阵,由它完成数据标准化和其他预处理。

expressionFamily参数用于指定表达矩阵的数据类型,有几个选项可以选择:

mycds是Monocle为我们的数据生成的对象,相当于我们在seurat使用的scRNA对象。数据导入后需要进行标准化和其他预处理:

与seurat把标准化后的表达矩阵保存在对象中不同,monocle只保存一些中间结果在对象中,需要用时再用这些中间结果转化。经过上面三个函数的计算,mycds对象中多了SizeFactors、Dipersions、num_cells_expressed和num_genes_expressed等信息。

提选择代表性基因

完成数据导入和预处理后,就可以考虑选择哪些基因代表细胞的发育特征,Monocle官网教程提供了4个选择方法:

前三种都是无监督分析方法,细胞发育轨迹生成完全不受人工干预;最后一种是半监督分析方法,可以使用先验知识辅助分析。第一种方法要求实验设计有不同的时间点,对起点和终点的样本做基因表达差异分析,挑选显著差异的基因进行后续分析。对于没有时序设计的实验样本,可以使用第2、3种方法挑选基因。第2种方法要先对细胞降维聚类,然后用clusters之间差异表达的基因开展后续分析。Monocle有一套自己的降维聚类方法,与seurat的方法大同小异,很多教程直接使用seurat的差异分析结果。第3种方法使用离散程度高的基因开展分析,seurat有挑选高变基因的方法,monocle也有自己选择的算法。本案例数据不具备使用第1、4种方法的条件,因此这里只演示2、3种方法的使用。

选择不同的基因集,拟时分析的结果不同,实践中可以几种方法都试一下。

降维及细胞排序

使用disp.genes开展后续分析

使用diff.genes分析的结果

轨迹图分面显示

Monocle基因可视化

拟时相关基因聚类热图

Monocle中differentialGeneTest()函数可以按条件进行差异分析,将相关参数设为fullModelFormulaStr = "~sm.ns(Pseudotime)"时,可以找到与拟时相关的差异基因。我们可以按一定的条件筛选基因后进行差异分析,全部基因都输入会耗费比较长的时间。建议使用cluster差异基因或高变基因输入函数计算。分析结果主要依据qval区分差异的显著性,筛选之后可以用plot_pseudotime_heatmap函数绘制成热图。

BEAM分析

单细胞轨迹中通常包括分支,它们的出现是因为细胞的表达模式不同。当细胞做出命运选择时,或者遗传、化学或环境扰动时,就会表现出不同的基因表达模式。BEAM(Branched expression analysis modeling)是一种统计方法,用于寻找以依赖于分支的方式调控的基因。

获取帮助

本教程的目的在于把常用的单细胞分析流程串起来,适合有一定R语言基础的朋友参考。分析原理和代码我没有详细解释,官网有详细的教程和权威的解释,翻译好的中文教程也有多个版本,有兴趣的可以搜索一下。如果您学习本教程有一定困难,可以点击 “阅读原文” 找到作者联系方式,获取帮助。

往期回顾

并不是所有的批次效应都可以被矫正




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